你是不是刚进实验室就被安排做Sanger测序？看着师兄师姐们熟练操作仪器，自己连PCR产物怎么纯化都搞不明白？别慌，当年我也是拿着移液器手抖的新手小白。今天咱们就掰开揉碎说清楚，??从沾满汗水的样本管到电脑屏幕上的峰图??，手把手带你走完整个流程。

??开头先泼盆冷水??
都说Sanger测序是金标准，可为啥你跑出来的序列总有杂峰？说白了就是细节没扣到位。举个真实案例：去年有个研究生因为用错终止液比例，白瞎了三个月实验数据。咱们先从??样本处理这个魔鬼藏在细节里的环节??说起。

??样本处理三要素??

1. ??DNA浓度必须＞20ng/μl??：浓度不够就像炒菜不放盐，跑电泳直接给你空白卷（偷偷说，用NanoDrop测完记得看A260/A280比值，1.8-2.0才是好样本）
2. ??引物设计要精准??：别随便从文献里扒序列，Tm值差2℃就可能扩增失败（推荐用Primer3在线工具，记得避开二级结构区域）
3. ??PCR产物纯化别偷懒??：那些残留的dNTP和引物就像米饭里的砂子，会搞砸测序反应（用磁珠法纯化时，80%乙醇洗两次绝对比一次干净）

??PCR扩增最容易翻车的点??
新手最常犯的错就是贪多。明明说明书写着25μl体系，非要加到50μl觉得更保险，结果引物浓度直接砍半。记住这组黄金参数：

• ??退火温度??=引物Tm值-5℃（比如Tm是58℃就设53℃）
• ??循环数25-30次??：超过35次会产生非特异产物
• ??延伸时间按1kb/分钟??计算（扩增800bp就设50秒）

上周隔壁实验室小王扩EGFR基因，设了35个循环，跑出来的胶都成拖尾了。后来重新做才发现，??过量扩增会产生引物二聚体??，这些短片段会优先被测序，结果出来的峰图全是噪音。

??测序反应配液就像调鸡尾酒??
BigDye终止液、模板DNA、测序引物这三者的比例，直接决定结果成败。重点来了：

• ??模板量??：100ng PCR产物或3μg质粒（千万别用基因组DNA直接测）
• ??BigDye用量??：1μl足够，加多了背景信号会飙升
• ??引物浓度??：3.2pmol/μl最保险（买来引物记得用OD值换算浓度）

配液顺序也有讲究：先加超纯水，再放引物，最后加BigDye。有次我忘记室温融化终止液直接冰上使用，结果染料结晶析出，跑出来的信号弱得像心电图。

??电泳条件设置是门玄学??
上机前务必确认这些参数：

• ??毛细管长度50cm??：长毛细管适合＞800bp的片段
• ??注射电压1.2kV??：电压太高会导致DNA断裂
• ??运行温度60℃??：高温能让DNA保持单链状态

突然想到个笑话：某同学把电压设成12kV，结果不仅序列没出来，毛细管直接烧了。维修费抵得上三个月补助金，这教训够喝一壶的。

??新手必问的五个问题??

1. ??为啥我的峰图总有双峰？??
   八成是PCR产物不纯，残留了引物二聚体。下次纯化时试试用0.8倍磁珠，能更好去除小片段。

2. ??测序引物能和PCR引物一样吗？??
   可以！但得注意方向。??PCR正向扩增，测序就得用反向引物??，这样才能读到目标区域。

3. ??样本浓度够但没信号咋办？??
   检查下BigDye是不是过期了（有效期就6个月），或者PCR产物里有抑制剂（比如酚氯仿没除净）。

4. ??前50个碱基总是不准正常吗？??
   正常！这是Sanger测序的通病。解决方法是用??M13通用引物加长测序读段??，或者直接截掉前面不可靠的部分。

5. ??手动测序和自动测序哪个好？??
   现在早没人用放射自显影了。自动测序仪虽然贵（每小时耗电200块），但准确率从85%提到99.99%，值回票价。

??结果分析别完全相信软件??
看到这里你可能要骂街：我都按流程做了，为啥电脑自动判读的序列还是有错？告诉你个行业秘密——??所有测序公司都会人工复核??。重点看这三个位点：

• 第100-300碱基：信号最清晰的黄金区域
• 同聚物区域（比如AAAAA）：容易漏读或错读
• 序列两端：质量值Q＜20的果断舍弃

有次我发现某个位点明明是T，软件显示成C。后来查原始峰图才发现，那个位置的峰形又矮又宽，手动修正才避免发错数据。

现在你应该明白，Sanger测序就像做拉面，看似简单的步骤藏着无数门道。但只要你死磕每个细节，这老技术照样能出顶级成果。下次遇到问题别急着换方法，先把移液枪校准下，说不定奇迹就在0.1μl的误差修正后出现。