为什么微生物需要长期保存？

微生物菌种作为科研和工业生产的核心资源，其活性维持直接影响实验结果的重现性和生产效率。菌种失活会导致实验数据不可靠、发酵生产失败等问题。保存的关键在于抑制代谢活动同时保持细胞结构完整，通常通过温度控制、脱水处理或化学保护实现。

实验室常用保存方法操作指南

冷冻干燥保存法

将菌悬液与保护剂（如脱脂牛奶）混合后，在零下50℃快速冻结，随后通过真空升华去除水分。需控制真空度在0.1mbar以下，冻干周期约24小时。复苏时使用专用复活培养基，梯度升温至37℃活化。

超低温甘油保存法

用30%灭菌甘油与菌液等体积混合，分装至冻存管后置于零下80℃冰箱。注意甘油浓度过高会破坏细胞膜，过低则无法防冻。该方法可保存5年以上，复苏时需快速解冻防止冰晶损伤。

液氮保存技术

添加15%二甲基亚砜作为低温保护剂，以每分钟1℃的速率程序降温至零下196℃。保存容器必须使用耐高压冻存管，避免液氮渗入引发爆炸风险。该方法保存期限可达10年以上。

保存失败后的补救措施

菌种复苏无活性怎么办？

检查冻存管密封性是否良好，确认复苏培养基营养成分完整。尝试梯度复温：先移至零下20℃冰箱12小时，再转至4℃解冻。必要时进行多代活化培养，恢复代谢功能。

保存菌种被污染如何处理？

立即停止使用同批次保存菌种，从原始保藏管重新复苏。建立双人复核制度，所有操作在生物安全柜内完成。污染菌种需121℃高压灭菌30分钟后再处理。

设备断电应急方案

零下80℃冰箱断电超过4小时，需立即转移菌种至备用液氮罐。日常应配备UPS不间断电源，保存箱内放置温度报警装置。建立菌种分布存储制度，避免单点故障导致全军覆没。

常见误区与科学保存建议

1. 反复冻融加速菌种衰亡：建议分装成单次使用量
2. 家用冰箱保存风险：普通冰箱温度波动±5℃，专业设备需控制±1℃
3. 忽视传代记录：每次复苏需记录代数，超过10代应更换原始菌种
4. 保护剂选择错误：芽孢杆菌适用海藻糖，乳酸菌优先选用脱脂牛奶
5. 保存验证缺失：每季度抽样检测活菌数，保存6个月后需做复苏测试

通过建立标准操作流程（SOP）、实施双人核对机制、定期维护保存设备，可有效保障微生物菌种保存质量。建议实验室配置电子化菌种管理系统，实现保存位置、代数、活性等数据的实时追踪。