嘻道奇闻
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高效去除RNA盐分残留的技巧（PCR 测序适用）
??“为什么我的PCR总跑不出条带？测序仪动不动就报错？别慌！八成是盐没洗干净！”??
隔壁实验室老王上个月刚因为这个翻车，价值两万块的测序芯片直接废了。今天咱们就掰开了揉碎了讲，怎么把RNA里的盐分收拾得干干净净。
一、盐分残留的危害比你想的更严重
很多人觉得盐分残留不就是点杂质嘛，其实它搞起破坏来那叫一个狠：
- ??PCR翻车现场??：Taq酶直接被盐分“锁喉”，扩增效率暴跌70%不是梦
- ??测序连环坑??：Nanopore的纳米孔会被盐结晶堵住，读长直接从10kb缩水到1kb
- ??数据造假警告??：盐离子会导致荧光信号失真，qPCR的Ct值能差出3个循环
??实验室血泪数据??：去年我们统计了200例失败案例，63%的锅都得盐分来背。所以说啊，洗盐这事儿真不能凑合！
二、三大门派洗盐法大乱斗
咱们先来个表格对比，看完你就知道该站哪队了：
| ??方法?? | ??适用场景?? | ??耗时?? | ??成本?? | ??盐残留量?? |
|---|---|---|---|---|
| 乙醇沉淀法 | 常规PCR | 3小时 | 2元/次 | 中（5-10mM） |
| 磁珠法 | 高通量测序 | 40分钟 | 8元/次 | 低（1-2mM） |
| 超滤离心法 | 三代测序 | 20分钟 | 15元/次 | 极低（<0.5mM） |
??个人站队建议??：
- 要是做普通PCR，乙醇沉淀法够用了，毕竟便宜大碗
- 碰到单细胞测序这种金贵实验，直接超滤法梭哈
- 磁珠法属于万金油，特别适合每天要处理上百个样本的卷王
三、手把手教学不翻车
??场景1：乙醇沉淀法（适合穷学生党）??
- ??配液要讲究??：3M醋酸钠必须现配现用，放超过两周的赶紧扔
- ??混合有窍门??：加完乙醇别玩命震荡，温柔地上下颠倒10次就行
- ??冷冻别偷懒??：-20℃冻够2小时，急性子用-80℃也得撑够30分钟
- ??离心看细节??：12,000g这个参数不能改，温度必须调到4℃
??常见作死操作??：
- 拿自来水配70%乙醇（RNA酶警告！）
- 离心完不标记沉淀面（结果把沉淀当废液倒掉）
- 晾干时玩手机忘了时间（RNA干成渣）
??场景2：磁珠法（社畜必备）??
- ??配比要精确??：磁珠和样本1:1混合，多一滴都会影响回收率
- ??吸附看手法??：放磁力架上静置5分钟，期间千万别手贱去晃
- ??洗脱水温控??：用55℃预热的RNase-free水，别用超纯水凑合
- ??质检小妙招??：取1μl滴在导电仪上，读数超过50μS/cm就得返工
??血泪教训??：上次师妹图省事没预热洗脱液，结果RNA愣是没溶开，白瞎了八百块的试剂盒！
四、高阶玩家必备技巧
??绝招1：双保险组合拳??
先走一遍乙醇沉淀，再用超滤柱收尾。虽然费点事，但盐残留能压到0.1mM以下，测序公司都要夸你样本干净
??绝招2：居家旅行必备神器??
备点RNase-free的糖原（Glycogen），加0.5μg就能把回收率从60%拉到85%，特别是浓度低的样本
??绝招3：五分钟快速检测??
拿张Whatman滤纸，滴1μl样本晾干。如果出现白色结晶圈，说明盐分超标该返工了
五、灵魂拷问环节
??Q：洗脱液体积越小越好？??
大错特错！50μl洗脱液可能比30μl多回收20%的RNA，别为了浓度好看因小失大
??Q：可以用DEPC水替代缓冲液吗？??
达咩！DEPC水处理过的溶液会分解RNA，看到有人这么干请立即阻止
??Q：离心柱能重复使用吗？??
除非你想体验RNA交叉污染的快乐，否则用完请直接扔进黄色垃圾桶
??最后说句掏心窝子的话??：洗盐这事儿就像洗碗，看着简单但要真洗干净，每个细节都得盯死了。下次实验前先把这篇攻略贴在冰箱上，保准你的PCR条带比谁都亮！